Phát hiện huỳnh quang là gì? Các nghiên cứu khoa học về Phát hiện huỳnh quang

Phát hiện huỳnh quang là kỹ thuật đo cường độ ánh sáng phát xạ từ fluorophore khi hấp thụ photon bước sóng ngắn và tái phát xạ ở bước sóng dài hơn. Kỹ thuật này thuộc phát quang động học với thời gian sống excited state ngắn (<10⁻³ s), mang lại độ nhạy cao cho phép phát hiện nồng độ pico- đến nano-molar trong mẫu phức tạp.

Định nghĩa và khái niệm cơ bản

Phát hiện huỳnh quang (fluorescence detection) là kỹ thuật đo lường sự phát xạ ánh sáng của các phân tử huỳnh quang (fluorophore) khi chúng hấp thụ photon có bước sóng ngắn và sau đó tái phát xạ ở bước sóng dài hơn. Quá trình này xảy ra nhanh chóng, thường trong thời gian dưới 10−³ giây, giúp thu nhận tín hiệu mạnh mẽ trong khi nền tạp nhiễu thấp.

Huỳnh quang thuộc dạng phát quang động học, khác với phosphorescence ở chỗ thời gian sống excited state ngắn hơn, do đó tín hiệu huỳnh quang có thể được phân biệt rõ ràng qua mặt thời gian. Tính chất này cho phép sử dụng huỳnh quang trong các ứng dụng phân tích đòi hỏi độ nhạy cao và khả năng định lượng ở nồng độ thấp.

  • Ưu điểm: độ nhạy cao, khả năng phát hiện nồng độ pM–nM, không xâm lấn mẫu.
  • Khả năng định vị không gian và thời gian khi kết hợp với kính hiển vi huỳnh quang.
  • Ứng dụng rộng rãi trong hóa sinh, y sinh, phân tích môi trường và công nghiệp.

Nguyên lý phát sinh huỳnh quang

Khi một phân tử huỳnh quang hấp thụ photon với năng lượng hνex, electron trong phân tử được kích lên trạng thái năng lượng cao Sn (n ≥ 1). Ngay sau đó, phân tử thường thư giãn nội phần tử (internal conversion) xuống trạng thái kích thích thấp nhất S1 thông qua các quá trình không bức xạ.

Từ trạng thái S1, phân tử có thể trở về trạng thái cơ bản S0 bằng cách phát ra photon có năng lượng hνem, với hνem < hνex. Bước sóng phát xạ λem thường lớn hơn bước sóng kích thích λex, tạo ra hiệu ứng Stokes shift giúp tách tín hiệu huỳnh quang khỏi tín hiệu kích thích.

Chu trình Jablonski minh họa quá trình hấp thụ, thư giãn không bức xạ và phát xạ huỳnh quang. Độ rộng băng sóng và hình dạng phổ phát xạ phụ thuộc vào đặc tính phân tử, môi trường dung môi và nhiệt động lực học của các trạng thái excited state.

Thành phần và cấu hình thiết bị phát hiện

Hệ thống phát hiện huỳnh quang cơ bản gồm nguồn kích thích, bộ lọc ánh sáng, và đầu dò tín hiệu. Nguồn kích thích có thể là đèn hồ quang thủy ngân, đèn xenon nhấp nháy hoặc laser đơn sắc, cung cấp ánh sáng có bước sóng phù hợp để kích thích fluorophore.

Bộ lọc và lưới tán sắc (monochromator) đóng vai trò tách riêng tia kích thích và tia phát xạ, đảm bảo chỉ ánh sáng huỳnh quang đi vào đầu dò. Cấu hình thường gồm bộ lọc band-pass cho excitation, dichroic mirror tách hai dải bước sóng, và bộ lọc emission cho detector.

Thành phầnChức năngVí dụ thiết bị
Nguồn kích thíchCung cấp ánh sáng kích thíchĐèn xenon, laser diode
Bộ lọc excitationChọn bước sóng kích thíchBand-pass filter (360–380 nm)
Dichroic mirrorTách quang phổ excitation/emissionChroma T450LP
Bộ lọc emissionChọn bước sóng phát xạBand-pass filter (450–480 nm)
DetectorThu tín hiệu huỳnh quangPMT, APD, CCD

Đầu dò có thể là photomultiplier tube (PMT) với độ nhạy cao và thời gian đáp ứng nhanh, hoặc cảm biến CCD/CMOS cho phép thu ảnh huỳnh quang với độ phân giải không gian. Trong các hệ đo vi mô, avalanche photodiode (APD) được dùng để phát hiện tín hiệu yếu với tỉ lệ tín hiệu/nhiễu tốt.

Phương pháp và chế độ đo huỳnh quang

Phổ tĩnh (steady-state fluorescence) đo phổ phát xạ tại điều kiện cân bằng ánh sáng kích thích. Dữ liệu thu được là cường độ phát xạ theo bước sóng, giúp xác định cực đại phát xạ và hiệu suất lượng tử.

Phương pháp phân giải thời gian (time-resolved fluorescence) ghi lại tín hiệu theo trục thời gian sau xung kích thích, cho phép xác định thời gian sống excited state (τ). Kỹ thuật này hữu ích khi cần phân biệt fluorophore có phổ xạ gần giống nhưng khác về thời gian sống.

  • Synchronous fluorescence: quét đồng thời λex và λem với độ lệch cố định Δλ để tăng độ phân giải tín hiệu.
  • Front-face vs. right-angle detection: cấu hình đo trực tiếp hoặc vuông góc để giảm tín hiệu tán xạ nền.
  • Fluorescence lifetime imaging (FLIM): cho phép hình ảnh hóa phân bố thời gian sống huỳnh quang trong mẫu sinh học.

Đặc tính quang học và tham số quan trọng

Hiệu suất lượng tử (quantum yield) của một fluorophore là tỉ số photon phát xạ so với photon hấp thụ:

Φ=NemitNabsΦ = \frac{N_{\mathrm{emit}}}{N_{\mathrm{abs}}}

Đây là tham số then chốt đánh giá độ sáng, thường dao động từ vài phần trăm đến gần 1 (fluorescein Φ≈0.9). Thời gian sống excited state (lifetime) τ xác định độ bền tín hiệu huỳnh quang và được tính bằng:

τ=1kr+knrτ = \frac{1}{k_r + k_{nr}}

trong đó k_r và k_{nr} lần lượt là hằng số phân rã bức xạ và không bức xạ. Thời gian sống thường trong khoảng pico- đến nanô-giây, cho phép phân biệt các fluorophore nhờ kỹ thuật time-resolved.

  • Hệ số hấp thụ (extinction coefficient) ε tại λex càng lớn, khả năng kích thích càng hiệu quả.
  • Stokes shift càng rộng (Δλ = λem – λex) càng dễ tách tín hiệu khỏi nền.
  • Photostability: fluorophore bền với photobleaching cho phép quan sát thời gian dài trong kính hiển vi.

Đối với ứng dụng đa màu, phổ excitation/emission phải ít chồng chéo, giúp tách tín hiệu khi kết hợp nhiều dấu huỳnh quang khác nhau trong cùng mẫu.

Ứng dụng trong sinh học và y sinh

Kính hiển vi huỳnh quang cho phép quan sát trực tiếp cấu trúc tế bào và mô với độ phân giải siêu nhỏ: tế bào nhân thực, ty thể, lưới nội chất đều có thể được đánh dấu bằng các fluorophore đặc hiệu (GFP, Alexa Fluor). Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) đo thời gian sống huỳnh quang cho phép phân biệt trạng thái pH, ion Ca²⁺ nội bào hoặc tương tác protein-protein.

  • Flow cytometry: phân tách tế bào theo cường độ huỳnh quang, định lượng protein bề mặt với độ nhạy cao.
  • Western blot huỳnh quang: sử dụng kháng thể gắn fluorophore cho phép phát hiện đồng thời nhiều protein trên cùng màng—khác với phương pháp hóa phát quang (chemiluminescence).
  • Huỳnh quang trong chẩn đoán y khoa: xét nghiệm ELISA huỳnh quang cho kết quả nhanh và định lượng chính xác nồng độ kháng thể/kháng nguyên.

Các fluorophore thế hệ mới như quantum dots (QD) và dye-doped nanoparticles có hiệu suất lượng tử cao, photostability tốt và có thể điều chỉnh bước sóng excitation/emission đa dạng, mở rộng ứng dụng trong sàng lọc thuốc và chẩn đoán hình ảnh vivo .

Ứng dụng trong hóa học và phân tích môi trường

Phương pháp HPLC–FLD (High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection) tăng độ nhạy gấp 10–100 lần so với HPLC-UV, dùng để phát hiện polyaromatic hydrocarbon (PAH), thuốc trừ sâu và hóa chất dược trong nước thải hoặc mẫu thực phẩm. LOD (limit of detection) có thể đạt 10⁻¹¹–10⁻¹³ mol/L.

  • Sensor huỳnh quang cho kim loại nặng (Pb²⁺, Hg²⁺): ligand chọn lọc gắn fluorophore đổi màu/phát sáng khi tương tác ion.
  • Phát hiện khí: màng polymer huỳnh quang thay đổi cường độ khi hấp thụ VOCs (volatile organic compounds).
  • Quan trắc môi trường tự động: hệ thống đo huỳnh quang sông hồ để theo dõi hợp chất hữu cơ hòa tan (Dissolved Organic Matter – DOM).

Thiết bị cầm tay portable fluorometer với laser diode excitation và cảm biến silicon photodiode cho phép đo tại hiện trường, rút ngắn thời gian trả kết quả so với phân tích phòng thí nghiệm .

Khả năng định lượng và độ nhạy

Phương phápLODLinear range
Steady-state FL10⁻⁹–10⁻¹² M10⁻⁸–10⁻⁶ M
Time-resolved FL10⁻¹⁰–10⁻¹³ M10⁻⁹–10⁻⁷ M
Sensor gắn ligand10⁻⁹ M10⁻⁹–10⁻⁵ M

Thời gian đo nhanh (tích hợp tín hiệu trong vài ms–s), độ tuyến tính vượt trội (R² > 0.99) nhờ tách tín hiệu huỳnh quang khỏi nhiễu nền. Kỹ thuật time-gated detection và lock-in amplification giảm nhiễu tán xạ và tín hiệu nền, cải thiện S/N ratio lên tới 10³–10⁴.

Thách thức và hạn chế

Photobleaching là hiện tượng fluorophore mất khả năng phát xạ sau khi chiếu sáng lâu, giới hạn thời gian quan sát. Giải pháp: sử dụng fluorophore ổn định, bổ sung chất chống oxi hóa (anti-fade agents) hoặc giảm cường độ excitation.

Phụ thuộc môi trường: pH, ion, áp suất và nhiệt độ có thể thay đổi phổ excitation/emission và hiệu suất lượng tử. Cần hiệu chuẩn mẫu trong điều kiện tương tự môi trường đo để đảm bảo kết quả chính xác.

  • Spectral overlap: khi dùng nhiều fluorophore, cần tách sóng và unmixing tín hiệu bằng phần mềm phân tích.
  • Quenching: tương tác không bức xạ giữa fluorophore và phân tử khác làm giảm cường độ—có thể là static hoặc dynamic quenching.
  • Chi phí thiết bị cao và yêu cầu kinh nghiệm vận hành hệ thống phức tạp.

Xu hướng nghiên cứu tương lai

Phát triển fluorophore hữu cơ bền vững, không độc và có hiệu suất lượng tử gần 1, phục vụ y sinh và môi trường. Các fluorophore cấu trúc cứng (rigidified) giảm non-radiative decay, tăng photostability.

Siêu phân giải (super-resolution) như STED, PALM/STORM kết hợp huỳnh quang cho phép quan sát cấu trúc sinh học ở độ phân giải < 20 nm, mở ra cái nhìn vi cấu trúc trong tế bào sống. Hyperspectral fluorescence imaging khai thác toàn phổ excitation/emission để phân tích đồng thời hàng chục dấu huỳnh quang khác nhau.

  • Ứng dụng AI/ML phân tách tín hiệu và phân loại fluorophore tự động từ dữ liệu đa chiều.
  • Fluorescent lifetime multiplexing: dùng thời gian sống khác nhau để gán mã số cho từng dấu huỳnh quang trong phân tích đa kênh.
  • Huỳnh quang siêu cảm biến (ultrasensitive): plasmonic-enhanced fluorescence, metal-enhanced fluorescence (MEF) cho LOD 10⁻¹⁴ M.

Tài liệu tham khảo

  • Valeur, B., & Berberan-Santos, M. N. (2012). Modern Fluorescence Spectroscopy. Springer.
  • Lakowicz, J. R. (2006). Principles of Fluorescence Spectroscopy (3rd ed.). Springer.
  • Selvin, P. R. (1996). “Fluorescence Resonance Energy Transfer,” Methods in Enzymology, 246, 300–334.
  • Wu, P., & Brand, L. (1994). “Resonance Energy Transfer: Methods and Applications,” Analytical Biochemistry, 218(1), 1–13.
  • Quantum Dot Review. Semiconductor Quantum Dots for Fluorescence Applications. https://www.nature.com/articles/natrevmats201719
  • Field Portable Fluorometer Applications. https://www.junipersys.com/portable-fluorometer

Các bài báo, nghiên cứu, công bố khoa học về chủ đề phát hiện huỳnh quang:

Xác định nồng độ picogram của Methylmercury bằng phương pháp Ethyl hóa pha lỏng, tiếp theo là khí chromatography cryogenic với phát hiện huỳnh quang nguyên tử hơi lạnh Dịch bởi AI
Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences - Tập 46 Số 7 - Trang 1131-1140 - 1989
Một kỹ thuật được trình bày cho phép xác định nhanh chóng và chính xác methylmercury trong các mẫu dung dịch. Mẫu được phản ứng đầu tiên với natri tetraethylborate, để chuyển đổi monomethylmercury không bay hơi thành methylethylmercury khí. Adduct bay hơi sau đó được tách ra khỏi dung dịch và thu hồi trên một cột carbon graphitic ở nhiệt độ phòng. Methylethylmercury sau đó được desorb nhi...... hiện toàn bộ
#Methylmercury #phân tích nước #ethyl hóa #huỳnh quang nguyên tử #kỹ thuật chromatography
Phát hiện Clavibacter michiganensis phân loài sepedonicus trong củ khoai tây bằng phương pháp BIO-PCR và hệ thống phát hiện huỳnh quang tự động thời gian thực Dịch bởi AI
Plant Disease - Tập 83 Số 12 - Trang 1095-1100 - 1999
Bệnh thối vòng ở khoai tây, do vi khuẩn Clavibacter michiganensis phân loài sepedonicus gây ra, là một trong những bệnh được kiểm soát một cách nghiêm ngặt ở khoai tây trên toàn thế giới. Tổ chức này thường khó phát hiện ở những củ không có triệu chứng do số lượng vi khuẩn thấp và sự phát triển cạnh tranh chậm trên các môi trường có sẵn. Các primer phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và một p...... hiện toàn bộ
#clavibacter michiganensis #thối vòng #tách chiết mẫu khoai tây #BIO-PCR #TaqMan
Cảm biến hóa học huỳnh quang chọn lọc dựa trên triaminophenylbenzene cho việc phát hiện acid picric Dịch bởi AI
New Journal of Chemistry - Tập 39 Số 2 - Trang 886-892

Một cảm biến hóa học huỳnh quang mới dựa trên triaminophenylbenzene đã được tổng hợp và sử dụng thành công để phát hiện acid picric một cách chọn lọc bằng phương pháp phát quang.

#cảm biến huỳnh quang #triaminophenylbenzene #acid picric #phát hiện chọn lọc
So sánh phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp trên mẫu lâm sàng để phát hiện kháng nguyên virus hợp bào hô hấp Dịch bởi AI
Journal of Clinical Microbiology - Tập 15 Số 5 - Trang 969-970 - 1982
Các phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên virus hợp bào hô hấp đã được so sánh. Trong số 50 mẫu ban đầu dương tính với virus hợp bào hô hấp qua phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và nuôi cấy, có 49 mẫu dương tính qua kiểm tra miễn dịch huỳnh quang trực tiếp lặp lại và 32 mẫu dương tính qua kiểm tra miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Các kết quả bổ sung th...... hiện toàn bộ
#miễn dịch huỳnh quang #virus hợp bào hô hấp #phát hiện kháng nguyên #mẫu lâm sàng
Tăng cường phát quang huỳnh quang màu xanh từ bột ZnO:Pr Dịch bởi AI
Journal of Materials Research -
Các bột phosphor ZnO doped Pr đã được chuẩn bị bằng phản ứng khô trong ống thủy tinh silica kín chân không. Pr2O3 và Pr6O11 được sử dụng làm phụ gia. Nồng độ Pr là 0.5, 1, 3 và 5 mol%, và nhiệt độ nung kết lần lượt là 600, 800 và 1000 °C. Quang phát quang (PL) và phổ kích thích quang phát quang (PLE) được đ...... hiện toàn bộ
#ZnO #Pr-doped #phát quang huỳnh quang #khuyết tật tự nhiên #phức hợp.
Phát triển công nghệ LIDAR dựa trên huỳnh quang cho cảm biến sinh học Dịch bởi AI
Springer Science and Business Media LLC - - 2005
Kết quả từ việc phát triển các hệ thống phát hiện tác nhân sinh học (BWA) dựa trên phát hiện quang phổ của huỳnh quang kích thích bằng laser cực tím (UV) được trình bày. Một bộ dao động quang học tham số (OPO) nhỏ gọn với sự trộn tần số tổng trong buồng để tạo ra bức xạ laser UV 293 nm đã được phát triển. Thiết bị OPO/SFM được bơm bởi một laser Nd:YAG (1064 nm) được bơm bằng diode, bao gồm cả sự t...... hiện toàn bộ
#tác nhân sinh học #phát hiện quang phổ #huỳnh quang #laser #hệ thống phát hiện
Phát triển hệ kính hiển vi huỳnh quang siêu phân giải ứng dụng trong nghiên cứu vi rút
Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam (bản B) - Tập 63 Số 11 - 2021
Kính hiển vi (KHV) huỳnh quang siêu phân giải là hệ kính ưu việt nhờ kết hợp tính năng chụp ảnh huỳnh quang với khả năng quan sát các mẫu sinh học vượt qua được giới hạn nhiễu xạ của KHV quang học. Hệ kính này giúp quan sát được mẫu sống với độ chính xác và độ phân giải cao. Vi rút là đối tượng đặc trưng cho nghiên cứu sử dụng hệ kính này do hầu hết các loại vi rút có kích thước nhỏ hơn giới hạn n...... hiện toàn bộ
#định vị đơn điểm #kính hiển vi huỳnh quang siêu phân giải #nanoscopy #STORM #vi rút sốt xuất huyết Dengue
Phương pháp Khuếch đại Isothermal bằng cách sử dụng Huỳnh quang Thời gian thực và Màu sắc Thị giác để xác định Nhanh chóng và Rõ ràng Giống Diodon Dịch bởi AI
Food Analytical Methods - Tập 15 - Trang 2487-2495 - 2022
Trong nghiên cứu hiện tại, các phương pháp khuếch đại isothermal (LAMP) bằng huỳnh quang thời gian thực (flo-LAMP) và quang màu thị giác (vis-LAMP) đã được thiết lập để nhận diện Diodon. Các mồi LAMP được thiết kế cho gen cytochrome oxidase I của Diodon, và tính đặc hiệu cao của chúng đã được xác thực khi so sánh với 21 loài cá khác. LAMP có giới hạn phát hiện tối thiểu là 0.5 pg/μL đối với DNA ge...... hiện toàn bộ
#LAMP #Diodon #khuếch đại isothermal #phát hiện nhanh #phương pháp màu sắc #ngộ độc cá
Xác định Phenytoin và các chuyển hóa chính của nó trong huyết thanh người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với phát hiện huỳnh quang Dịch bởi AI
Analytical Sciences - Tập 15 - Trang 371-375 - 1999
Một phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có phát hiện huỳnh quang có độ nhạy cao đã được phát triển để xác định đồng thời phenytoin và các chuyển hóa chính của nó [5-(3-hydroxyphenyl)-5-phenylhydantoin và 5-(4-hydroxyphenyl)-5-phenylhydantoin]. Sau khi chiết xuất các hợp chất này và 5-(4-methylphenyl)-5-phenylhydantoin (MPPH) làm chuẩn nội từ huyết thanh (50 μl) bằng acetate ethyl, chúng đã được ...... hiện toàn bộ
#Phenytoin #sắc ký lỏng hiệu năng cao #phát hiện huỳnh quang #chuyển hóa #huyết thanh
Thực hiện phương pháp Tìm kiếm Đường thẳng cho Phân tích PARAFAC đối với Ma trận phát xạ và kích thích huỳnh quang Dịch bởi AI
Journal of Applied Spectroscopy - Tập 90 - Trang 82-87 - 2023
Việc phục hồi các nhóm fluorophore trong chất hữu cơ hòa tan bằng cách sử dụng phân tích tensor chuẩn PARAFAC của ma trận kích thích - phát xạ huỳnh quang (EEM) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu nước tự nhiên. Tuy nhiên, việc điều chỉnh mô hình PARAFAC, đặc biệt là để xác thực, rất tốn thời gian. Một số chiến lược để tăng tốc độ điều chỉnh PARAFAC cho EEM của nước biển đã được xem xét. Các ch...... hiện toàn bộ
#PARAFAC #ma trận phát xạ - kích thích huỳnh quang #nước tự nhiên #chất hữu cơ hòa tan #tối ưu hóa siêu tham số.
Tổng số: 46   
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5